相关研究表明，当今水产养殖快速发展面临最大的障碍是由病原体感染诱发的各种鱼类疾病。目前，鱼类免疫防御病原体感染的分子机制已成为免疫学研究的热门领域。宿主识别外界病原菌入侵的机制在防御病原微生物感染的过程中发挥重要的作用；病原的识别激活机体特异性和非特异性免疫应答，从而快速消灭入侵的病原菌。因此，转录组测序分析有助于揭示鰤鱼诺卡氏菌（Nocardiaseriolae）感染杂交鳢（Channamaculata♀×Channaargus♂）后机体中参与特异性和非特异性免疫应答的免疫相关基因表达情况。
此研究通过腹腔注射100μL1.0×109CFU·mL-1鰤鱼诺卡氏菌刺激杂交鳢48h，分离杂交鳢血液淋巴细胞进行转录组测序分析，探究鰤鱼诺卡氏菌刺激杂交鳢免疫相关基因表达影响，对差异表达的免疫相关基因进行筛选与分析，为进一步了解鰤鱼诺卡氏菌致病机制与杂交鳢防御机理奠定基础。主要的研究结果如下：
1、测序数据和质量评估
利用Illumina平台进行测序，N.seriolaestrainZJ0503刺激组（Ns组）与PBS对照组（Ctr组）分别获得了49839332和50059283条Rawreads；过滤后分别得到了49759366和49981784条Cleanreads，其中Cleanreads占Rawreads的比列分别为99.84%和99.85%。对两组测序样本可信度分析显示CleanreadsGC（%）平均含量47.33%和46.04%；Q20平均值为94.24%和94.32%。Q20表示转录组测序错误率分别为1%，用于评价转录组测序数据质量的好坏程度。一般来说测序质量会随着Reads的增长而下降，Reads的Q20高于设定的阈值，Reads质量更可靠（表1）。所有原始数据已上传至NCBI，登录号为SRP144407。
表1Cleanreads的质量分析
2、差异表达基因分析
一共检查到的表达基因为17196条，其中注释基因12999条，差异表达基因(Differentiallyexpressedgenes(DEGs))共2892条，包括上调基因1387条和下调基因1505条（图1）。
图1N.seriolae刺激组（Ns组）与PBS对照组（Ctr组）间的差异表达基因火山图
X轴：Ns与Ctr组的表达量变化；Y轴：差异表达基因（DEGs）统计学显著性分析；蓝点：无显著差异表达的基因；红点：显著上调表达的基因；绿点：显著下调表达的基因。
3、GO功能注释
转录组测序分析获得所有的DEGs均聚类到三种GeneOntology(GO)功能注释类型，其中包括生物进程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）（如图2所示）。此外，在所有的差异表达基因中，下调基因的数量多于上调基因；而在参与免疫相关的差异表达基因部分（如：Immuneresponse,Immunesystemprocess,Antigenprocessingandpresentation,Cytokinereceptoractivity,MHCclassIproteincomplex,MHCclassIIproteincomplex和MHCproteincomplex），上调基因的数量多于下调基因。
图2差异表达基因进行GeneOntology（GO）功能注释
X轴：差异表达基因数；Y轴：GO功能注释类型，包括生物进化（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）类型；红色条形：上调基因；绿色条形：下调基因。
4、KEGG通路富集
其中的2502条DEGs分别富集于246条KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)通路，富集的前20条通路如图3所示。此外，在246条KEGG通路数据中，检测出与免疫相关通路具有14条（表2）。
图3差异表达基因（DEGs）富集的前20条KEGG通路
X轴：通路的富集系数；Y轴：KEGG通路类型；富集系数表示在通路中差异表达基因（DEGs）与所有基因的比例，数量20-100的基因用不同大小的点表示，q阈值用不同的颜色表示。
表2免疫相关通路分析
5、qRT-PCR验证
根据转录组测序分析反馈数据，随机挑选16条基因进行qRT-PCR验证。结果显示，qRT-PCR验证随机挑选的16条基因的表达趋势与RNA-seq一致，如图4所示，表明此转录组测序分析数据具有较高的可信度。
图4RNA-seq与qRT-PCR分析差异表达基因（DEG）变化趋势比较
6、小结
鰤鱼诺卡氏菌刺激组（Ns组）与PBS对照组（Ctr组）分别组装了49839332和50059283条rawreads，过滤后的cleanreads分别占75.50%和74.25%。差异表达基因一共2892条，其中上调表达基因占1387条，下调表达基因占1505条。对差异表达基因进行GO与KEGG通路富集分析，获得功能注释的差异表达基因具有2502条，分布于246条通路中。对富集于前20KEGG通路中的免疫相关基因进行筛选与比较分析。随机挑选16个显著性差异表达的免疫相关基因进行qRT-PCR验证，验证结果与测序的变化趋势一致，表明转录组测序结果具有较高的可靠性。该研究为进一步了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理与杂交鳢的免疫防御机制奠定了基础。
