作者：暨南大学水生生物研究所，热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心，广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室 罗新，张其中
摘要:通过纸片琼脂扩散法分别测定了42种中草药提取液pH值调节至中性前后对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径大小，用t检验对药液pH值调节至中性前后的抑菌效果进行分析比较，结果表明差异极显著(P=0.002＜0.01)。采用试管二倍稀释法测定了6种中草药在调节pH值至中性后对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，结果表明:在药液pH值调节至中性后，五倍子(Rhuschinensis)、诃子(Terminaliachebula)和黄连(Coptischinensis)三种中草药能有效抑杀嗜水气单胞菌，五倍子的MIC和MBC都为7.813mg/mL，诃子的MIC和MBC均为15.625mg/mL，黄连的MIC和MBC均为62.5mg/mL；石榴皮和艾叶的MIC和MBC均为250mg/mL；乌梅的MIC和MBC均为1000mg/mL。
关键词:嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)；中草药；抑菌试验；最低抑菌浓度；最小杀菌浓度
嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)广泛分布于池水、淤泥等自然环境，常引起鱼、鳖、鳗、牛蛙及蚌等水生动物败血症及局部感染，导致水产动物大量死亡，给水产养殖业造成经济损失。目前尽管已有针对嗜水气单胞菌的疫苗，但由于该菌存在不同血清型，致使免疫保护效果差或不稳定，因此，主要还是用抗菌药物防治。但抗生素的大量使用诱导致病菌产生耐药性，导致抗生素失效。同时过去水产上常用的抗菌药物(如环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和呋喃唑酮等)的残留威胁消费者健康和阻碍水产品出口创汇，现已被禁用。所以，开发安全、高效、环保的新型抗菌水产药物迫在眉睫。中草药是天然药物，具有毒性低、易降解、安全环保等特点，有的种类含多种抑菌活性物质，能抑制细菌生长，有的种类还能增强水产养殖动物免疫力，因此，中草药具有开发成安全环保水产抗菌药物的潜在价值。但是，由于不同中草药的抗菌力各异，需要进行针对病原菌的筛选试验，找出抗菌效果好的中草药，以便在生产实践中应用，以减少抗生素的使用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
嗜水气单胞菌为本实验室保存菌株。
1.1.2实验药物
42种用于试验的中草药如表1所示。
1.1.3培养基
本试验采用pH为7.2～7.4的普通牛肉膏培养基，其液体培养基配方为:牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、水1000ml。固体培养基为每100ml液体培养基加入1.5g琼脂。
表1试验所用中草药名录
1.2方法
1.2.1菌液制备
在试管中倒入5ml普通牛肉膏液体培养基，接种嗜水气单胞菌后，在恒温摇床中28℃下震荡(200r/min)培养6～8h。采用平板计数法计数，用液体培养基稀释菌液至1×107cfu/ml，置4℃冰箱中保存备用。
1.2.2药液制备
每种中草药各称取10g，用150ml蒸馏水浸泡2h，然后在电炉上加热煎煮30min，收集药液；残渣再加入150mL蒸馏水，煎煮30min，收集药液。合并两次药液，加热浓缩至10ml，使其终浓度相当于生药1g/ml。用0.5mol/L的NaOH将药液的pH值调至中性附近。121℃高压灭菌20min，灭菌后置冰箱中保存备用。
1.2.3药敏纸片制备
用打孔器(孔径为6mm)在滤纸上打孔，制备直径为6mm的圆形滤纸片，放培养皿中经高压灭菌，再烘干。烘干后用纸片吸取各种药液(每片纸片的药量约为0.667mg)，然后烘干，放于灭菌试管中，置4℃冰箱中保存备用。
1.2.4药物抑菌试验
采用纸片琼脂扩散法(k-b纸片扩散法)，即取80μl菌悬液涂布平板，然后贴上制备好的中药药敏纸片，注意均匀分布。每种中草药做三个平行，在28℃条件下培养24h，然后测定抑菌圈直径，每个抑菌圈在两个方向各测量两次，取其平均值。中草药抑菌效果等级划分，参照参考文献，并略作调整:抑菌圈直径小于8mm为无抑菌作用，用“－”表示；8～11mm为弱抑菌作用，用“+”表示；11～16mm为中等抑菌作用，用“++”表示；16mm以上为强抑菌作用，用“+++”表示。
1.2.5最低抑菌浓度(MIC)的测定
综合考虑中草药经调节pH值至中性前后的抑菌试验作用来选择用于MIC测定试验的中草药，并且将药液pH值调节至中性后用于试验。测定方法采用试管二倍稀释法，即取试管14支，依次编号，其中1支作为空白对照，其余13支用液体培养基对中草药提取液进行二倍梯度稀释；每管各加入100μl嗜水气单胞菌菌液，使其细菌终浓度为5×105cfu/ml。置28℃摇床中震荡(200r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，无混浊现象所对应的药物浓度就为该中草药对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度(简称MIC)。
1.2.6最小杀菌浓度(MBC)
在MIC实验基础上，把无细菌生长的各管摇动混匀，然后在28℃条件下再震荡(200r/min)培养24h，观察结果。无菌生长对应的最低药物浓度就为该中草药对嗜水气单胞菌的最小杀菌浓度(MinimalBactericidalConcentration，简称MBC)。
1.2.7数据处理方法
用Excel软件处理数据，用SPSS13.0软件进行统计分析。
2结果与分析
2.1不同中草药的抑菌效果
从表2抑菌圈的直径大小来看，冰片、五倍子、乌梅、石榴皮、诃子、黄连和艾叶7种中草药水提原始药液能够有效抑杀嗜水气单胞菌，其中以冰片的抑菌作用最强，五倍子、乌梅、石榴皮和诃子等4种中草药次之，黄连和艾叶2种中草药相对较弱。将原始药液pH值调节至中性后，只有五倍子、诃子和黄连表现出较好的抑菌作用，冰片、乌梅、石榴皮和艾叶等4种中草药的抑菌圈明显减小。
采用SPSS13.0软件的成对样本t检验分析方法对药液在调节pH至中性前后的抑菌圈直径大小进行差异显著性分析，t=3.303，P=0.002＜0.01，表明药液在调节pH前后的抑菌圈直径大小存在极显著差异。
表242种中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果
注:①表示水提原始药液；②表示将pH值调节至中性的水提液。
2.2最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
采用试管二倍稀释法测定药物的MIC和MBC，结果见表3。将原始药液pH值调节至中性后，五倍子和诃子2种中草药的MIC和MBC最小，其中五倍子的MIC和MBC均为7.813mg/ml，诃子的MIC和MBC均为15.625mg/ml；黄连次之，其MIC和MBC均为62.5mg/ml；石榴皮和艾叶2种中草药的MIC和MBC较大，均达到250mg/ml；乌梅的MIC和MBC最大，都为1000mg/ml。所以，五倍子、诃子和黄连3种中草药表现出较好的抑杀嗜水气单胞菌作用。
表3中草药对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度
3讨论
试验结果发现冰片、五倍子、乌梅、石榴皮和诃子5种中草药的水提原始药液的pH值分别是2.241、3.924、2.943、3.445和3.224，在抑菌试验中表现出较好的抑菌作用，但是，将药液pH值调节至中性后，冰片、乌梅和石榴皮的抑菌作用极显著降低，甚至没有(冰片)抑菌作用，仅五倍子和诃子仍有较明显抑菌效果，推测可能是冰片、乌梅和石榴皮在抑菌试验中所表现的抑菌作用主要是其药液的酸性抑制了细菌生长和繁殖，而非抗菌活性物质的作用。进一步对调节pH前后的水提液抑菌圈直径进行成对t检验，结果表明抑菌圈直径在调节pH前后存在极显著差异(P=0.002＜0.01)，所以，药液的pH值是影响中草药抑菌效果的一个重要因素，将提取液的pH值调至中性后进行抑菌试验是非常必要的。
在本试验中，五倍子和诃子对嗜水气单胞菌有较强的抑杀作用，这和彭金菊等的研究结果一致。五倍子含有鞣质成分，该成分对蛋白质有沉淀作用和收敛作用；同时五倍子具有强大广谱抗菌作用。诃子含有大量鞣质和多种酶，具收敛、止泻作用，对病原微生物具有抑制作用。但是，乌梅(MIC和MBC均为1000mg/ml)和石榴皮(MIC和MBC均为250mg/ml)在本试验中对嗜水气单胞菌的抑菌作用很弱，这和彭金菊等(乌梅的MIC和MBC分别为12.500g/ml和25.000g/ml，石榴皮的MIC和MBC分别为12.500mg/ml和12.500mg/ml)、曹良等(乌梅的MIC为133.3mg/ml)的研究结果不同，主要原因可能是本试验中所采用的中草药提取液的pH值都被调节至中性后再用于试验。另外与供试菌株的分离源、菌株的血清型、中草药的采集地、药用部位、煎煮方法可能也有关系。在实际生产中，将具有抑菌作用的中草药组合成复方，利用不同中草药相互协同作用来防治嗜水气单胞菌引起的疾病，这样可以更好地发挥中草药的抑菌作用。
